TP purification du lysozyme du blanc d'oeuf

Dans le cadre de mon épreuve sur dossier pour l'agreg interne, je comptais aborder, dans la partie pédagogique, une séquence de TP sur la purification du lysozyme à partir du blanc d'oeuf. Je voudrais monter cette séquence en réel pour mes BTS. J'ai trouvé quelques protocoles mais j'ai quelques questions là-dessus :
-Dans certains protocoles, on demande de concentrer les fractions de purification obtenues avant le passage en électrophorèse. Est-ce nécessaire? (j'ai regardé et le sephadex G25 préconisé pour cette étape coûte cher et la concentration doit se faire dans la nuit avec récupération de la solution concentrée le lendemain , hors, je ne les vois qu'une fois par semaine en TP).
-Dans un autre protocole, on parle de concentration des fractions de purification par l'éthanol mais on ne donne pas le protocole. Du coup, je ne me rend pas compte si c'est long et donc réalisable avec mes contraintes horaires.
-Auriez-vous un protocole complet qui fonctionne pour me donner une idée?
Je comptais vérifier la pureté par électrophorèse sur cellogel et la comparer avec les résultats sur électrophorèse PAGE-SDS.
Voilà, si vous avez des réponses, je suis preneuse. En parallèle, je continue mes recherches sur internet. Merci

J'ai purifié pas mal de protéines quand je bossais dans la recherche, mais avec du matériel de labo et pas de salle de TP. Sans voir le protocole auquel tu fais allusion, il m'est difficile de dire ce qui est faisable ou pas.
- vu la concentration en lysozyme dans le blanc d'oeuf, à moins d'utiliser une méthode de purification qui dilue énormément les fractions, je ne pense pas que les concentrer avant SDS-PAGE soit indispensable. Une coloration au bleu de coomassie est largement assez sensible pour rendre visible quelques dizaines de µg/mL. A la limite, mieux vaut ne pas trop concentrer, ça ferait apparaître des impuretés.
- le sephadex G25 est une résine d'exclusion, ça coûte effectivement cher, et ça sert à séparer les protéines sur un critère de taille native. Ca peut effectivement être utile pour purifier le lysozyme, qui est petit (14 kDa je crois) par rapport aux autres protéines, mais pas à le concentrer: la chromato d'exclusion dilue forcément ce qu'on met dessus, surtout quand la protéine est petite et sort dans les dernières fractions.
- purifier par l'éthanol ou par le sulfate d'ammonium est une méthode qui repose sur la précipitation fractionnée. C'est assez pratique, pas cher et ça doit assez bien fonctionner pour le lysozyme. Le risque c'est que la protéine précipitée soit dénaturée, mais le lysozyme est extrêmement stable grâce à ses 4 ponts disulfures. Ce n'est pas très représentatif des méthodes habituelles de purification, mais au moins on peut faire un test fonctionnel après (genre lyse d'une culture de bactérie genre E.coli ou de micrococcus lysodeicticus lyophilisé suivie par absorbance à 600 nm, ou "trous" dans un tapis de coli sur boîte de Petri).
- toute purification du lysozyme sur colonne pose le même problème: la "base" de la résine, quelle qu'elle soit, est souvent un polymère glucidique qui a tendance à se faire bouffer par le lysozyme (c'est peut-être là l'idée qui sous-tend la "concentration" sur sephadex: on reviendrait en fait à une pseudo-purification du lysozyme par affinité pour un pseudo-substrat).
- si des BTS savent manier les pI, je ferais une chromato d'échange d'ion. Le lysozyme a un pI assez élevé proche de 11 (ça se calcule à partir de la séquence code 1 lettre chez swiss-prot: http://web.expasy.org/compute_pi/ ) et doit être bien séparé du reste (calculer le pI du principale contaminant, l'ovalbumine) sur échangeur de cations genre carboxyméthylcellulose (pas cher, et la cellulose ne risque rien de la part du lysozyme à cause de ses liaisons beta-osidiques non hydrolysables). Charger à pH neutre ou légèrement basique, laver à pH=10 et éluer à pH 11 avec 1M NaCl ou un peu au-delà de 11 (tampon Tris par exemple, qui est bon à ces pH). L'avantage de l'échange d'ion c'est que ça concentre d'emblée. Quel que soit le tampon dont on se sert pour l'élution, tout test fonctionnel derrière passera par une forte dilution dans la sauce réactionnelle, pas besoin de dialyser ta protéine pour la ramener dans des conditions où elle est active.
- Je n'ai pas de protocole tout prêt, mais pour suivre à peu près une purification, il faut pouvoir doser les protéines (totales) des fractions (pour savoir quand on doit s'arrêter de laver la colonne). Un test de Bradford est assez pratique pour ça: on voit le résultat à l'oeil nu à la couleur, même sans spectrophotomètre. Sinon il faut mesurer l'absorbance des fractions en cuve de quartz en UV à 280 nm, je ne crois pas que ce soit possible dans un lycée.
Je suppose que tu es tombé sur ça:
http://moodle.utc.fr/file.php/38/PolyTPBL01P2012.pdf

Merci pour toutes ces données et pour le lien. Oui, je suis tombée là-dessus, effectivement et ce fut très instructif.
Je comptais effectivement faire une chromato d'échange d'ions sur carboxyméthyl cellulose pour séparer le lysozyme du reste, puis, vérification qu'il n'est pas dénaturé et que c'est bien lui qu'on a obtenu, par mesure de l'activité enzymatique, dosage par Bradford (parce que, même si nous avons des cuves en quartz, nous n'en avons que deux et je sais comme c'est fragile donc non, ils ne les utiliseront pas) puis électrophorèse (comparatif entre une électrophorèse horizontale non dénaturante pour qu'ils voient bien que le lysozyme migre différemment des autres protéines du blanc d'oeuf et une électrophorèse PAGE-SDS. Pour ces deux électrophorèses, je ferai migrer la solution mère de blanc d'oeuf et la fraction de lysozyme purifié).